FerroFarRed (Fe²⁺indicator) 亞鐵離子熒光探針

產品標簽

FerroFarRed；FeRhoNox-1；FerroOrange；Labile ferrous ion 不穩定鐵(II)離子；Fe2+熒光探針Ferroptosis 鐵死亡；C11 BODIPY 581/591 脂質過氧化探針；

產品信息

產品描述

FerroFarRed，也稱為SiRhoNox-1、ER-SiRhoNox，是一種特異性檢測不穩定的鐵(II)離子（Fe2+）的熒光探針。FerroFarRed基本無熒光，一旦與Fe2+反應后，不可逆的生成一種遠紅熒光產物（Absmax=646nm，FLmax=662nm，圖1. FerroFarRed的光譜特征）。生理濃度下的鐵（III）離子（Fe3+）或其它除鐵離子以外的二價金屬離子都不會使其熒光增強（見圖2. FerroFarRed的金屬離子反應特異性）。FerroFarRed具細胞膜滲透性和高選擇性，且在高達100μM的濃度下對細胞幾乎無毒性，適用于活細胞內Fe2+的檢測，傾向定位在內質網（ER）。適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀以及流式細胞儀（配置紅色激光器）分析。

圖1.FerroFarRed的光譜特征。FerroFarRed在0.05M HEPES buffer，pH 7.4下的吸收光譜（左）和熒光光譜（右）。FerroFarRed的吸收波長在646nm，而熒光波長在662nm。

圖2.FerroFarRed的金屬離子反應特異性。FerroFarRed（5 μM）與各種金屬離子反應后，用熒光酶標儀測定熒光強度（激發波長：630nm，發射波長665nm）?？梢?，僅與Fe2+反應后發生顯著的熒光增強。

保存與運輸方法

保存：≤-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   FerroFarRed傾向定位在內質網，但也可能檢測細胞質池內的Fe2+，目前針對這一點未做明確評估。

2）   熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

3）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明

一、 需要自行準備的材料

1.1 細胞培養級或超純DMSO（比如：MS4601A-100ML）【強烈建議將高純的DMSO分裝成單次用量保存在極低溫冷凍室內，比如-80℃，避免吸潮。降解的DMSO可能會增加FerroFarRed的背景信號】

1.2 合適的觀察緩沖液（比如：PBS, pH 7.4；HBSS；等）。不要含酚紅。

1.3    無血清細胞培養基（D-MEM等）

二、探針準備

2.1從冰箱取出FerroFarRed，置于室溫回溫至少30min，將其置于微量離心機內低速離心。將瓶內的粉末離心到管底后，再開蓋。

2.2 往一管FerroFarRed（50nmol）內加入50μl 高質量DMSO，用槍反復吹吸5次或以上，使其完quan溶解即得到1mM FerroFarRed儲存液。【注意：FerroFarRed是藍色固體，但溶液幾乎無色（淺藍色）】。建議單次用完儲存液，若實在用不完，請根據單次用量分裝，置于-80℃避光保存。用中性緩沖液來稀釋儲存液。

三、HeLa細胞Fe2+的染色步驟（熒光成像分析）

3.1 在玻底培養皿內接種細胞，培養過夜。

3.2從培養皿內吸走培養基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗兩次。

3.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

3.4 將染色工作液加入培養皿內，于37℃孵育1h。

【注意：①建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間。②如果細胞很容易從培養皿上脫落，建議使用多聚L-賴氨酸或其它包被基質包被的培養皿來接種細胞?！?/p>

3.5 染色后用觀察緩沖液（比如：HBSS）清洗一次，替換成新的觀察緩沖液。

3.6 在熒光顯微鏡下觀察細胞。

四、HepG2細胞Fe2+的測定（流式分析）

4.1 于多孔培養板內接種細胞，過夜培養。

4.2 從培養板內吸走培養基，用合適的觀察緩沖液（比如：HBSS）輕輕的清洗兩次。

4.3 用無血清細胞培養基稀釋1uM FerroFarRed儲存液，制備成5mM的染色工作液。

4.4 將染色工作液加入培養板內，于37℃孵育1h。

【注意：建議根據細胞類型和自身實際需求優化工作濃度和孵育時間?！?/p>

4.5 染色后，用PBS清洗一次，之后加入0.25% yi酶-EDTA消化細胞。

4.6 于冰上用PBS稀釋0.25% yi酶-EDTA，之后500 x g離心細胞懸液5min，以沉淀細胞。

【注意：不可用血清來中和yi酶。】

4.7 吸走上清，用PBS重懸細胞。

4.8 用細胞篩網（40μm尼龍篩網）過濾細胞，去除細胞碎片。

4.9 上機，流式細胞儀分析。

五、熒光檢測

對于激光激發：635nm波長左右的激光器比較適合。熒光在660nm左右觀察。

對于熒光顯微鏡觀察：選擇檢測Cy5的紅色激發濾片。對于流式分析，選擇檢測APC的濾片。

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FerroFarRed的染色示例（來自文獻）

Ref 1. Li Z, Jiang L, Chew SH, et al. Carbonic anhydrase 9 confers resistance to ferroptosis/apoptosis in malignant

mesothelioma under hypoxia. Redox Biology. 2019 Sep;26:101297. DOI: 10.1016/j.redox.2019.101297. PMID:

31442913; PMCID: PMC6831888.

檢測方法（Fe(II)的細胞定位）：Catalytic Fe(II) was detected with a fluorescent turn-on probe, SiRhoNox-1 (FerroFarRed;), as previously described. Cells (5?×?104) were cultured in normoxia on 35-mm glass bottom dish  for 16?h?at 37?°C. After treatment with CA9 inhibitors under hypoxia for 48?h, cells were co-stained with 5?μM of SiRhoNox-1 and 200?nM of LysoTracker Green in FluoroBrite DMEM for 30?min?at 37?°C in normoxia, followed by incubation with 75?nM of MitoTracker Red for another 30?min. We confirmed that 1-h incubation in FluoroBrite DMEM containing 0.1?mg/L (0.25?μM) Fe(NO3)3 scarcely affects iron metabolism of the cells within this limited period. Medium was replaced with new FluoroBrite DMEM, followed by observation with a confocal microscope (LSM880, Carl Zeiss; Oberkochen, Germany). The excitation/emission used for SiRhoNox-1, LysoTracker and MitoTracker probes were 633/670, 504/511 and 579/599?nm, respectively. Local signal intensity of the regions overlapped with each organelle-trackers were analyzed with ZEN Imaging Software (Carl Zeiss).

Fig. 1  CA9 overexpression in MM cells correlates with increased catalytic Fe(II) in response to hypoxia. (F) Differential levels of catalytic Fe(II) in normoxia or hypoxia of ACC-Meso-1?cells were determined by staining with SiRhoNox-1 (5?μM), followed by evaluation with a flow cytometer after 48 h-incubation. (G) Localization of catalytic Fe(II) in normoxic or hypoxic ACC-Meso-1?cells were analyzed by co-staining of SiRhoNox-1 (5?μM), LysoTracker (200?μM) and MitoTracker (75?μM) after 48 h-incubation and observation with a confocal microscope. Integrated intensity per cell (N?=7) was quantified by ZEN Imaging Software (ZEISS) (means ± SEM; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P<?0.001 vs each control unless indicated by bar). Refer to text for details. SM, sarcomatoid mesothelioma; EM, epithelioid mesothelioma; N, normoxia; H, hypoxia; A.U., arbitrary unit.

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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