EHA105(pSoup-p19) Chemically Competent Cell

農桿菌化學感受態細胞

產品標簽：

EHA105菌株；農桿菌感受態細胞；Rifampicin（Rif） 利fu平；Kanamycin（kan）卡那mei素；EHA101；LBA4404；GV3101；AGL1；植物轉基因研究；

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產品描述：

EHA105菌株由EHA101菌株改造而來，染色體背景為C58，核基因含篩選標簽—利fu平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的琥珀堿型Ti質粒pEHA105（pTiBo542DT-DNA），此質粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA105（pTiBo542DT-DNA）質粒自身的T-DNA轉移功能雖被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移）。在EHA105菌株中轉入help質粒：pSoup-p19，即得到：EHA105 (pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2系列質粒在農桿菌中復制，同時賦予該菌株四環素（tetR）抗性，適用于水稻、煙草等植物的轉基因操作。

我司（懋康生物）提供的EHA105 (pSoup-p19)化學轉化感受態細胞經特殊工藝制作，基因型為C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT- DNA) Succinamopine (pSoup-p19-tetR)，經pGs2質粒檢測轉化效率>104 cfu/μg DNA。

產品組分：

保存與運輸條件：

保存：-80℃保存，1年有效。

運輸：干冰運輸。

注意事項

1） 感受態細胞應保存在-80℃，不可反復凍融和放置時間過長，以免降低感受態細胞的轉化效率。

2） 整個轉化操作，嚴格根據相應溫度及無菌條件要求進行。

3） 加入質粒的體積不應大于感受態體積的1/10。質粒不純或存在乙醇等有機物污染，會導致轉化效率急劇下降。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。

4） 為確保轉化效率，整個操作過程應盡量輕柔，并保持低溫。

5） 轉化高濃度的質粒可相應減少最終涂板用量。

6） 平板上克隆密度過大時，由于營養不足，克隆生長變慢，菌落變小。為獲得大菌落，應減少質粒用量。

7） 培養基中加入利fu平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入鏈mei素或慶大mei素可防止Ti質粒丟失，但鏈mei素不利于農桿菌的轉基因操作，一般培養農桿菌時不考慮鏈mei素或慶大mei素，因Ti質粒丟失的概率極低（基本可以忽略）

8） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1) 取-80℃保存的感受態細胞于室溫或手心片刻待其部分融化，達到冰水混合狀態時插入冰浴中使其完quan融化。

2) 往100μl感受態細胞懸液中加入0.01~1μg（體積不大于10μl）質粒DNA，用手撥da管底使其混勻，依次于冰上靜置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

【注意】：次使用，建議做預實驗確定所加質粒的用量。

3) 加入700μl無抗生素的LB或YEB液體培養基，于28℃振蕩培養2-3h。

4) 6,000rpm離心1min，吸掉600ul上清，之后用槍輕輕吹打重懸菌體。之后加到含相應抗生素的LB或YEB平板上，用無菌玻棒輕輕的將細胞均勻涂開。室溫正置10 min，待液體被吸收后，倒置平板，28℃培養2-3天。

【注意】：當平板只含50μg/ml卡那mei素時，28℃培養48h即可；當平板中同時加入50μg/ml卡那mei素和10μg/ml利fu平時，需28℃培養48-60h；當平板中同時加入50μg/ml卡那mei素和20μg/ml利fu平時，需28℃培養60-72h；不建議使用超過20μg/ml的利fu平用于平板或液體培養。

5）目的克隆的液體培養：

j小量搖菌：往15ml的圓底透氣試管中加入1ml含對應抗生素的LB液體培養基，從新鮮培養的平板上挑1-2個單菌落接種，30℃，200rpm搖菌24-48h。

k大量搖菌：100ml透氣三角瓶內加入少于20ml含對應抗生素的LB液體培養基，取小搖菌液按2%比例接菌，30℃，200rpm搖菌24-48h。

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附表1固體和液體LB培養基配方

附表2固體和液體YEB培養基配方

附表3常見農桿菌對抗生素敏感性總表

— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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