Calcein AM/PI Double Stain Kit 活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒

產(chǎn)品關(guān)鍵詞：

Calcein, AM 鈣黃綠素AM；Calcein Red 鈣黃綠素紅；活細(xì)胞染色探針；Fluorescein diacetate (FDA)；Propidium Iodide (PI) 碘化丙啶；CAS NO：148504-34-1；

產(chǎn)品信息

【溫馨提示】：見(jiàn)我司懋康生物（maokangbio）整理的鈣黃綠素（Calcein）系列產(chǎn)品專(zhuān)題。

【溫馨提示】：見(jiàn)我司懋康生物（maokangbio）整理的鈣黃綠素AM（Calcein AM）單個(gè)產(chǎn)品信息。

產(chǎn)品描述

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細(xì)胞膜滲透性的活細(xì)胞熒光染料，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。AM基團(tuán)的存在不僅加強(qiáng)疏水性，使其能輕易穿透活細(xì)胞膜。而且封閉結(jié)合鈣離子的分子部分，本身不發(fā)熒光。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解為鈣黃綠素（calcein），能與胞內(nèi)鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。因不具有細(xì)胞膜滲透性，從而被保留在胞內(nèi)。與其它活細(xì)胞染料（如BCECF-AM，CFDA）相比，Calcein, AMzui適he用于活細(xì)胞染色探針，因細(xì)胞毒性很低，而且不會(huì)抑制任何細(xì)胞功能如增殖或淋巴細(xì)胞趨化性。另外，使用Calcein, AM活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分可信，與標(biāo)準(zhǔn)的51Cr釋放法所得結(jié)果一致。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein, AM僅對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這一特征使其非常適合用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞的短期示蹤。常常與碘化丙啶PI聯(lián)合使用，因其僅能穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域到達(dá)細(xì)胞核，嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm），僅對(duì)死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。結(jié)合這些特點(diǎn)，Calcein, AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用作活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

本試劑盒就是結(jié)合Calcein-AM和PI的雙重染料，來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)試劑盒優(yōu)化體系，單次以200µl細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，分別可做500次（貨號(hào)：MX3012-500T）和1000次（貨號(hào)：MX3012-1000T）檢測(cè)。

試劑盒組分

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃避光保存，有效期一年。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）由于Calcein-AM對(duì)濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據(jù)單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來(lái)水清洗。

3）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、試劑準(zhǔn)備

1.1 1×反應(yīng)緩沖液（Assay Buffer）的配制

從低溫冰箱內(nèi)取出10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無(wú)菌條件取出適量，用去離子水（dH2O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。

1.2   1×染色工作液（Stain Buffer）的配制

1）   先將低溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化。【注意：次使用時(shí)建議對(duì)儲(chǔ)存液根據(jù)單次用量分裝，特別是Calcein AM，以減少反復(fù)凍融次數(shù)。】

2）   取5µl Calcein AM溶液 (4 mM)和15µl PI溶液（1.5 mM）加入5ml 1×Assay Buffer，充分混勻。此時(shí)得到Calcein AM的工作液濃度為4μM，PI的工作液濃度為4.5μM。由于不同細(xì)胞系的染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用zui低的探針濃度得到zuihao的熒光結(jié)果。【注意：染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。】

二、染色步驟

2.1  對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用細(xì)胞刮刀或者yi酶-EDTA消化細(xì)胞，之后離心收集細(xì)胞（1000 rpm，3min）。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接離心（1000 rpm，3min）收集細(xì)胞。

2.2  去上清，用1×Assay Buffer充分清洗細(xì)胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

2.3  用1×Assay Buffer制備細(xì)胞懸液，使其密度為1×105~1×106細(xì)胞/ml。

2.4  取100µl染色工作液加入200µl細(xì)胞懸液內(nèi)，混勻，37℃孵育15min。

【注意：如果需要，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30min。】

2.5  熒光顯微鏡下使用490±10 nm激發(fā)濾片同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測(cè)。

【注意】：可以使用以下方法來(lái)優(yōu)化得到兩種熒光染料的工作濃度。

a)  用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細(xì)胞10min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30min，從而制備死細(xì)胞；

b)  用0.1-10µM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對(duì)細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。

c)  用0.1-10µM的Calcein AM進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

測(cè)定方法與結(jié)果呈現(xiàn)

1）  熒光顯微鏡（Fluorescent Microscopy）

檢測(cè)方法：490±10 nm激發(fā)能同時(shí)看到呈黃-綠色熒光的活細(xì)胞和紅色的死細(xì)胞。另，545nm激發(fā)可能只能看到呈紅色的死細(xì)胞。

Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2） 熒光酶標(biāo)儀（Fluorescent Plate Reader）

檢測(cè)方法：96孔透明底的黑色酶標(biāo)板（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm；PI檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為530nm，發(fā)射波長(zhǎng)為617nm；

3） 流式細(xì)胞儀（Flow cytometer）

檢測(cè)方法：流式細(xì)胞儀，Calcein檢測(cè)的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/535nm，PI的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為488/620nm。

Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

常見(jiàn)問(wèn)題

1、  該試劑盒適用任何細(xì)胞類(lèi)型？

基本上適用于任何含酯酶活性的動(dòng)物細(xì)胞。植物和細(xì)菌細(xì)胞因含有細(xì)胞壁，Calcein-AM不能進(jìn)入因此無(wú)法染色。有可能對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行染色。

2、  用相同濃度有可能對(duì)所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行染色？

對(duì)所有細(xì)胞都用相同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的工作濃度根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型差異很大。有必要根據(jù)具體細(xì)胞來(lái)確定染料濃度。參考說(shuō)明書(shū)染料工作濃度優(yōu)化方法。

3、  Calcein-AM對(duì)細(xì)胞有毒？

與其他相似的活細(xì)胞染料比較，Calcein-AM基本無(wú)毒（毒性最小）。見(jiàn)文獻(xiàn)EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)

相關(guān)產(chǎn)品

— —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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文獻(xiàn)引用：

[1]

Zhang XX et al. Characterization and property of dual-functional Zn-incorporated TiO2 micro-arc oxidation coatings: The influence of current density. Journal of Alloys and Compounds Volume 810, 25 November 2019, 151893

After the formazan was dissolved by dimethyl sulfoxide (DMSO), the optical density (OD) was then determined using enzyme-labeled instrument (iMark, BIO-RAD, US) at the wavelength of 570 nm. To reveal the viability of adherent MC3T3-E1 cells, a Live/Dead Double Staining Kit (MKBio, China).was employed. After 1 day culture, ... stained with Calcein acetoxymethyl ester (Calcein AM) and propidium.

[2]

Zheying Meng et al. Marriage of Virus-Mimic Surface Topology and Microbubble-Assisted Ultrasound for Enhanced Intratumor Accumulation and Improved Cancer Theranostics.

Calcein-AM and PI were purchased from Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

[3]

Xijian Liu et al. Facile synthesis of biocompatible cysteine-coated CuS nanoparticles with high photothermal conversion efficiency for cancer therapy. Dalton Trans., 2014,43, 11709-11715

Calcein AM/propidium iodide (PI) double stain kit, propidium iodide(PI), and fluorescein isothiocyanate (FITC) were purchased from Shanghai Maokang